Введение
Инсектная аллергия (ИА) — раздел аллергологии, объединяющий иммуноопосредованные реакции гиперчувствительности, возникающие при ужалениях, укусах насекомыми, при соприкосновении с ними, вдыхании частиц тел насекомых и/или продуктов их жизнедеятельности. Аллергические реакции на ужаление пчелой, осой, шершнем — насекомыми, относящимися к отряду перепончатокрылых (Hymenoptera), характеризуются тяжестью симптомов, бурным течением и риском летального исхода, что обусловлено парентеральным введением яда в организм человека при ужалении [1]. Характер аллергической реакции зависит от вида насекомого, продолжительности и интенсивности воздействия яда, а также от индивидуальной чувствительности человека к аллергенам насекомого.Распространенность ИА к яду перепончатокрылых в России составляет 0,4–8% [2]. В США выраженные местные реакции на ужаления жалящих насекомых встречаются в 2,4–26,4% общей популяции населения. Системные реакции выявлены у 0,5–3,3% обследованных жителей США. Среди взрослого населения Европы сенсибилизацию к жалящим насекомым выявляют в 9,2–28,7% случаев, а статистическое наблюдение системных реакций колеблется от 0,3 до 7,5% [3]. В России системные реакции отмечены у 5,8% обследованных пациентов с гиперчувствительностью к ужалениям перепончатокрылыми насекомыми [4]. Смертность от анафилактических реакций на яд перепончатокрылых насекомых составляет 0,03–0,48 случая на миллион населения ежегодно. Наиболее выраженным сенсибилизирующим воздействием отличается яд пчелы медоносной (Apis mellifera). Среди пчеловодов распространенность сенсибилизации к яду пчел составляет 15–43% [2, 4].
Согласно данным WHO/IUIS субкомитета по номенклатуре аллергенов в составе яда пчел A. mellifera содержится 12 аллергенов. По количественному содержанию аллергенов в пчелином яде в научной литературе имеются данные, указанные в таблице 1 [1, 5, 6].
По данным И.С. Гущина и соавт., аллергенная активность ферментов и пептидов яда медоносных пчел распределяется следующим образом: очень высокую аллергенную активность проявляет фосфолипаза А2 (Api m1), высокую аллергенность — гиалуронидаза (Api m2), умеренную аллергенность — кислая фосфатаза (Api m3). Слабую аллергенность проявляют мелиттин (Api m4), аллерген С (Api m5) [1]. T.C. Brown et al. приводят следующие данные: фосфолипаза А2 (Api m1) обладает высокой аллергенной активностью, гиалуронидаза (Api m2) — аллергеностью между слабой и средней; кислая фосфатаза
(Api m3) — слабой аллергеностью; меллитин (Api m4), дипептидилпептидаза IV (Api m5), богатый цистеином ингибитор трипсина (Api m6) — слабой аллергенностью; икарапин (Api m10) — аллергенностью между средней и высокой; основные белки маточного молочка Api m 11.0101 и Api
m 11.0201 — слабой аллергенностью [6].
Структура мелиттина изучена давно, он является основным компонентом яда пчел и представляет собой пептид, состоящий из 26 аминокислот (молекулярная масса
2840 Да) [7]. Мелиттин составляет 35–50% общей массы сухого яда пчелы, химически представлен следующей аминокислотной последовательностью: NH2-Гли-Иле-Гли-Ала-Вал-Лей-Лиз-Вал-Лей-Тре-Тре-Гли-Лей-Про-Ала-Лей-Иле-Сер-Три-Иле-Лиз-Арг-Лиз-Арг-Глн-Глн-CONH2.
Пептид состоит из двух спиральных областей и неструктурированной С-терминальной области. В водной среде мелиттин формирует тетрамер, состоящий из двух димеров. В водных растворах молекулярная масса мелиттина изменяется от 2840 Да (мономер мелиттина) до 11200 Да (тетрамер мелиттина), при этом изменяется и объем молекулы [8].
Расположение мономеров в кристаллической форме и водной среде различается. В нативном яде 90% мелиттина содержатся со свободной NH2-группой и 10% — в виде N1-формил-мелиттина. В растворах с низкой ионной силой он присутствует в виде мономера, а в растворах с высокой ионной силой и цельном яде — в виде тетрамера [8]. Изоэлектрическая точка мелиттина лежит в щелочной области. По данным ряда авторов, мелиттин относительно термоустойчив, он не разрушается при 20-минутном нагревании в кипящей водяной бане. Полипептид обладает поверхностной активностью.
Начало молекулы (1–20-я аминокислоты) обусловливает гидрофобность мелиттина, а гидрофильная сильно щелочная часть представлена остатками 21–26. В работе E. Habermann в 1958 г. показано, что амфифильность мелиттина служит структурной основой его способности снижать поверхностное натяжение растворов. Мелиттин вызывает разрушение эритроцитов, а также других клеток и их органелл [9].
Амфифильная молекула пептида «заякоривается» в наружном слое мембраны благодаря электростатическим взаимодействиям и вклинивается в бислой липидов мембраны, причем мелиттин способен встраиваться как в природные, так и в синтетические мембраны [10]. При этом он способен вносить существенные изменения не только в состав липидов, находящихся в непосредственной близости, но и изменять свойства липидов, находящихся на сравнительно большом расстоянии, что было продемонстрировано в 1979 г. при исследовании липидно-белковых взаимодействий [11].
Исследование основных биологических эффектов мелиттина было проведено в 1980–1990 гг., и устновлена их связь с его способностью менять или нарушать структуру мембран [12]. Связываясь с мембраной, пептид способен образовывать каналы, в результате чего повышается проницаемость для ионов, что может вызвать лизис клеток [13]. При этом наблюдается накопление Na+, Са2+ и утечка К+, пропорционально количеству мелиттина, взаимодействующего с мембраной [14]. Мелиттин ингибирует работу различных АТФ-аз, в результате чего нарушается транспорт ионов через мембрану [15]. Кроме того, мелиттин усиливает работу Nа+-К+-насоса, увеличивая вход натрия в клетку, при этом может инициироваться митогенез, стимулироваться синтез ДНК [16].
Токсическое действие мелиттина усиливается при взаимодействии с органеллами клеток, что вызывает высвобождение ферментов из лизосом или медиаторов (гистамин, брадикинин) из гранул тучных клеток, базофилов крови и тромбоцитов. Мелиттин реагирует также и со связанными с мембранами ферментными системами. Например, он повреждает катион-активированную АТФ-азу и ацетилхолинэстеразу и прерывает окислительное фосфорилирование в митохондриях [17]. Эти эффекты свидетельствуют о высокой токсичности мелиттина.
В качестве объектов исследования секреции гистамина наиболее широко используют следующие виды клеток: тучные клетки крыс и мышей, выделенные из брюшной и плевральной полостей, а также базофильные лейкоциты, выделенные из периферической крови человека. Эти типы клеток удобны прежде всего своей доступностью для повседневных исследований, они достаточно полно охарактеризованы, разработаны эффективные способы выделения этих клеток, описаны доступные разнообразные их активаторы, используемые для оценки их функционального состояния. Возможность широкого использования клеток-мишеней аллергии некоторых видов животных (крыс, мышей) и человека облегчает применение этих объектов в доклинических испытаниях противоаллергических фармакологических препаратов [18].
Известно, что мелиттин обладает выраженными антибактериальными, противовирусными и противовоспалительными свойствами. Однако неспецифическая цитотоксичность и гемолитическая активность ограничивают его терапевтическое применение. В последние годы растет интерес к потенциальным свойствам мелиттина [19].
Как правило, для работы используют мелиттин пчелиного яда (ПЯ) зарубежной фирмы Sigma, отличающийся высокой стоимостью. Интерес представляет изучение свойств мелиттина из отечественного яда пчелиного сырца (ЯПС).
Целью настоящей работы являлось изучение гистаминолиберирующих свойств мелиттина пчелиного яда отечественного производителя.
Материал и методы
Работа выполнена на базе лаборатории молекулярныхмеханизмов аллергии ФГБУ «ГНЦ Институт иммунологии» ФМБА России. Проведено исследование гистаминолиберирующих свойств мелиттина, полученного из отечественного ЯПС ООО «Апис», по методике определения высвобождения гистамина из тучных клеток крыс [18]. Работа проводилась на тучных клетках, полученных из перитонеальной жидкости крыс самцов популяции Wistar. Мелиттин исследовался в следующих концентрациях: 0,1, 0,25, 0,5, 1, 2,5, 5 и 10 мкг/мл. В качестве препарата сравнения брали мелиттин, полученный из ПЯ фирмы Sigma.
Использованные в работе образцы мелиттина были получены из очищенных экстрактов ЯПС ООО «Апис» и ПЯ фирмы Sigma путем хроматографического разделения, методом гельфильтрации с помощью хроматографической системы среднего давления FPLC Pharmacia Biotech и откалиброванной по молекулярной массе колонки Superdex 75HR. Работа проводилась с применением различных методов. На первом этапе процент высвободившегося из тучных клеток гистамина определяли с помощью флуоресцентного спектрофотометра. Далее количество высвободившегося из тучных клеток гистамина (в нг/мл) определяли с помощью иммуноферментного метода, с использованием набора Histamine ELISA (Германия).
Также проведено исследование ингибирующего действия нингидрина на высвобождение гистамина из тучных клеток, вызванное мелиттином. Работа проводилась на тучных клетках, полученных из перитонеальной жидкости крыс самцов популяции Wistar. Мелиттин, полученный из ЯПС ООО «Апис», исследовался в концентрациях 5 и 10 мкг/мл. В качестве препарата сравнения брали мелиттин, полученный из ПЯ фирмы Sigma. В работе использовали нингидрин (ингибитор NH2-групп) фирмы Sigma в следующих молярных концентрациях: 0,001, 0,0001, 0,00001 М. Количество высвободившегося из тучных клеток гистамина (в нг/мл) определяли с помощью иммуноферментного метода, с использованием набора Histamine ELISA (Германия).
Результаты исследования
Полученные данные количественного определения высвобождения гистамина представлены в таблице 2. Результаты свидетельствуют, что мелиттин, полученный из отечественного ЯПС ООО «Апис», и мелиттин, полученный из ПЯ фирмы Sigma, по дозозависимому воздействию на высвобождение гистамина из тучных клеток достоверно не отличаются между собой.
Полученные на втором этапе работы результаты при определении количества высвободившегося из тучных клеток гистамина с помощью иммуноферментного метода отражены в таблице 3.
Результаты показывают, что мелиттин в концентрациях от 0,1 до 0,25 мкг/мл вызывает высвобождение гистамина из тучных клеток менее 10%. Воздействие мелиттина в концентрациях от 0,1 до 0,25 мкг/мл вызывает высвобождение гистамина из тучных клеток, которое не превышает 4 нг/мл.
Таким образом, разными методами доказана гистаминолиберирующая активность мелиттина, а также выявлена прямая зависимость высвобождения гистамина из тучных клеток крыс при воздействии различных концентраций мелиттина, полученного из ядов различных производителей.
На заключительном этапе работы проведено исследование ингибирующего действия нингидрина (органического соединения, относящегося к классам кетонов, спиртов и конденсированных карбоциклов, используемого как качественный и количественный реактив при определении первичных аминов и аминокислот) на высвобождение гистамина из тучных клеток, вызванное мелиттином в различных концентрациях. Исследование показало, что наиболее токсичными для тучных клеток являются концентрации мелиттина 5 и 10 мкг/мл, что подтверждено в тесте деструкции тучных клеток количеством поврежденных клеток — 60% (мелиттин ЯПС «Апис»), 64% (мелиттин ПЯ Sigma) и 70% (мелиттин ЯПС «Апис»), 72% (мелиттин ПЯ Sigma) соответственно. Результаты воздействия мелиттина ЯПС «Апис» и мелиттина ПЯ фирмы Sigma представлены в таблице 4.
Исследование ингибирующего действия нингидрина на высвобождение гистамина из тучных клеток, вызванное мелиттином, показало возможность снижения токсического действия мелиттина на тучные клетки при действии ингибитора свободных NH2-групп. Ингибирующее действие нингидрина на высвобождение гистамина из тучных клеток выявлено в концентрациях 0,001 и 0,0001 М.
