Введение

Синдром Ашера (Usher syndrome, USH) является аутосомно-рецессивным заболеванием, на которое приходится почти половина всех случаев сочетанной наследственной глухоты и слепоты. По оценкам, распространенность USH составляет от 3,2 до 6,2 на 100 000 [1]. Тем не менее распространенность может быть до 1 на 6000. USH проявляется нарушением слуха, вестибулярной дисфункцией и пигментным ретинитом (RP) (синоним — тапеторетинальная абиотрофия сетчатки). В зависимости от возраста начала и тяжести клинических проявлений USH подразделяют на три основных клинических подтипа: USH1, USH2 и USH3. USH1 является наиболее тяжелой формой, наблюдающейся с рождения или с манифестацией до 5 лет, которая возникает в результате мутаций в любом из 6 генов: MYO7A, USH1C, CDH23, PCDH15, USH1G и CIB2. USH2 связан с мутациями в 3 генах: USH2A, ADGRV1 и DFNB31. USH3 вызван мутациями в гене CLRN1. Недавно был выделен 4-й атипичный USH, который возникает в результате мутаций в любом из генов: HARS, CEP250, PDZD7, C2orf71. На долю USH1 приходится около трети всех зарегистрированных случаев USH, на долю USH2 — две трети. USH3 протекает клинически наиболее благоприятно, встречается очень редко (~3%).

В течение последних нескольких лет были предприняты значительные усилия для описаний молекулярных характеристик, спектра мутаций и диагностики USH в различных популяциях, в т. ч. в испанской [2], американской [3], европейской [1], датской [4], финской [5], британской [1], алжирской [6], итальянской [7], немецкой [8], арабской [9], африканской [6] и китайской [10]. Современные методы секвенирования следующего поколения (next generation sequencing — NGS) значительно улучшили эффективность молекулярной характеристики в USH [1, 3, 11–13]. Кроме того, традиционный метод Сэнгера и метод мультиплексной амплификации (Multiplex ligation-dependent probe amplification — MLPA) успешно применяются для выявления глубоких интронных мутаций, больших делеций/дупликаций и вариаций числа копий генов (copy number variation — CNV).

Работы, в которых были представлены молекулярный профиль пациентов при центральных дистрофиях сетчатки в российской популяции [14] и генотип/фенотип корреляции в единичных клинических случаях пациентов с USH [15], уже были опубликованы авторами. Тем не менее нет опубликованных данных по USH в российской когорте в соответствии с утвержденным протоколом клинических исследований.

Цель исследования: изучить спектр мутаций российской когорты пациентов с USH в рамках наблюдательного исследования NCT03319524 [16] и провести анализ метаболома и интерактома, а также патогенетических путей развития USH для поиска путей таргетного лечения.

Материал и методы

28 пациентов из группы 3214 пациентов (11 мужчин, 17 женщин; возраст — 47,6±12,7 года; возрастной диапазон проявления заболевания — 0–18 лет) с наиболее выраженными клиническими симптомами USH (нейросенсорная тугоухость 3–4 степени и сужение полей зрения до 5–15 градусов) были приглашены к участию. Национальный состав группы: 21 пациент (75%) — русские, 3 (10%) — украинцы, 2 (7%) — евреи, 1 (4%) — белорус и 1 (4%) — чуваш. Письменное информированное согласие было получено у всех 28 пациентов, исследование было одобрено Независимым международным этическим комитетом (Москва).

Клиническое обследование: каждому пациенту проводилась биомикроскопия, периметрия, визометрия, оптическая когерентная томография (ОКТ), офтальмоскопия с фоторегистрацией, электроретинография (ЭРГ), запись зрительно вызванных потенциалов, 32-оттеночный цветотест Хью, тональная и электронная аудиометрия, измерение акустического импеданса, вестибулометрия, электронистагмография и постурометрия. Молекулярно-генетическое подтверждение клинического диагноза выполнено методом высокопроизводительного параллельного секвенирования ДНК. Был проведен подробный компьютерный анализ патогенетических путей развития клинической картины у 20 пациентов с подтвержденным диагнозом USH. Использовалось программное обеспечение HGVS, Genemap, Genemania, CLINVAR, Genego, STRING, Cytoscape и база данных консорциума EMBL для моделирования интерактома и анализа полученных данных.

Результаты и обсуждение

Частота обнаруженных мутаций в обследованной когорте пациентов составила: 50% в гене USH2A, 39% — MYO7A, 5% — PCDH15, 3% — USH1C, 3% — CDH23, характеристика которых представлена авторами ранее [17] (табл. 1). Для обсуждения терапевтических подходов к коррекции утраченных или недостаточных функций генов в данной группе пациентов необходимо изучение и сопоставление всех факторов, которые влияют на патогенез заболевания, в т. ч. учет молекулярно-генетических факторов и факторов внешней среды: (геном —> транскриптом —> протеом —> метаболом), в совокупности образующих интерактом, которые определяют фенотип того или иного пациента [18]. Регуляции метаболизма в сетчатке обеспечиваются:
1) количеством ферментов в зависимости от активации или ингибирования транскрипции и синтеза белков; 2) каталитической активностью ферментов, что контролируется аллостерическими модуляторами, активаторами, конкурентными ингибиторами (т. е. агонистами и антагонистами) и посттрансляционными модификациями, такими как фосфорилирование, ацетилирование и гликозилирование под контролем гормонов, ростовых факторов и нейротрансмиттеров; 3) субстратной доступностью (концентрацией), которая зависит от систем активного мембранного транспорта (помпы, транспортеры, требующие затрат энергии) и пассивной диффузии через субстрат-специфические мембранные белки (ионные каналы), которые контролируются концентрационным градиентом. В процессе фототрансдукции происходит передача зрительного сигнала, начиная с захвата фотонов сетчаткой глаза и завершая формированием зрительных образов в зрительной коре головного мозга. Подробнее о геномном контроле фототранс­дукции можно узнать, изучая функцию каждого из белков фототрансдукции, транслируемых с указанных генов, сначала по отдельности, а затем собирая в одну общую сеть интерактома. Изучение интерактома, т. е. полного набора взаимодействий между молекулами в отдельной клетке, как непосредственных физических контактов между белками (белок-белковые взаимодействия), так и непрямых взаимодействий генов (например, эпистаз, ап-регулирование, ко-активация, влияние факторов транскрипции и пр.), позволяет выделять наиболее перспективные терапевтические мишени. В то время как данные об экспрессии матричной рибонуклеиновой кислоты (мРНК) генов и данные протеомного анализа не раскрывают полностью всего того, что может происходить в клетке, метаболические профили (изучение метаболома сетчатки) [19, 20] могут дать мгновенный снимок физиологических процессов в клетке. Одна из задач современной медицины, системной биологии и функциональной геномики — это интегрирование данных протеомики, транскриптомики и метаболической информации для получения более целостного представления о строении и функции сетчатки у конкретного пациента. При компьютерном анализе и изучении взаимодействия наиболее активных генов метаболизма сетчатки при USH в изучаемой когорте выяснилось, что в 67% случаев наблюдается физическое взаимодействие генов, в 13% — ко-экспрессия, в 6% — ко-локализация, в 4% — совместные метаболические пути, в 1,4% — генные взаимодействия, 0,59% имеют общие белковые домены. В 6% случаев взаимодействие генов или белков, синтезируемых с этих генов, не доказано, но по некоторым предсказательным алгоритмам их взаимодействие вероятно.

Анализ интерактома (рис. 1) показывает, что у протокадгерина (PCDH15) большая сеть контактов с кадгеринами (CDH23), у ушерина (USH2A) — с разными видами коллагенов (COL4A3), у миозина (MYO7A) — с вирлиновым комплексом (WHRN) и различными подвидами актина (ACTA2, ACTG2). Примечательно, что MYO7A взаимодействует с гармонином, что позволяет предположить, что он может участвовать в закреплении верхнего конца цилии стержня фоторецептора (видоизмененные реснички). MYO7A также взаимодействует с некоторыми сплайс-формами протокадгерина (PCDH15), предполагается, что этот моторный белок может участвовать в формировании комплексов на обоих концах реснички (рис. 2).

MYO7A — ген, кодирует одну из форм белка миозина, расположен на 11-й хромосоме и имеет 55 экзонов. Миозин действует как моторный белок, управляемый АТФазой, для транспорта меланосом и фагосом вдоль нитей актина в пигментном эпителии сетчатки, а также для транспорта опсина и других белков фототрансдукции в фоторецепторах. Мутации в гене MYO7A вызывают тяжелую и глубокую непрогрессирующую нейросенсорную тугоухость, пигментный ретинит до начала подросткового периода и часто с вестибулярной арефлексией. Острота центрального зрения обычно лучше, чем 0,3, в первые два десятилетия жизни. Поля зрения у пациентов с USH1B начинают сужаться в средней периферии и переходят к остаточным небольшим центральным островкам с небольшими участками периферических полей зрения на самых поздних стадиях заболевания. Офтальмоскопически у пациентов наблюдаются стушеванность артерий и атрофия ретинального пигментного эпителия (РПЭ) с пигментацией по типу «костных телец». Аутофлуоресценция глазного дна может показать кольцо гипер­аутофлуоресценции в макуле. ОКТ часто выявляет потерю наружных слоев сетчатки и присутствие кистозного макулярного отека. Ганцфельд-ЭРГ почти всегда нерегистрируемая или амплитуды сигналов сильно снижены.

В сетчатке большая часть молекул миозина MYO7A находится в пигментном эпителии сетчатки (РПЭ), где происходят многие реакции зрительного ретиноидного цикла. V.S. Lopes et al. наблюдали [21], что сетчатка с мутациями в MYO7A устойчива к острому световому повреждению по причине более низкого уровня RPE65, изомеразы RPE, которая играет ключевую роль в ретиноидном цикле. Было показано, что RPE65 обычно подвергается светозависимой транслокации, чтобы стать более сконцентрированным в центральной области клеток RPE. Эта транслокация требует участия моторного белка MYO7A, поэтому при мутациях в гене MYO7A RPE65 частично локализован на свету и распадается быстрее, возможно, из-за его неправильной локализации, что дает правдоподобное объяснение его более низким уровням. После 50–60% фотозасвета сетчатка с мутацией в MYO7A демонстрирует повышенные уровни всех трансретиниловых эфиров на начальных стадиях темнового восстановления, что согласуется с дефицитом активности RPE65. Наконец, MYO7A и RPE65 совместно иммунопреципитируются из клеточного лизата RPE антителами против любого из белков, и два белка были локализованы в одних и тех же участках клетки, что указывает на их прямое или косвенное взаимодействие. Вместе результаты подтверждают роль MYO7A в транслокации RPE65, иллюстрируя участие молекулярного мотора в пространственно-временной организации ретиноидного цикла в процессе фототрансдукции [21].

На основе этих знаний можно предположить, что зарегистрированный и разрешенный к применению на территории США препарат Luxturna (воретиген непарвовек), представляющий собой рабочую копию гена RPE65 на аденовирусном носителе, в будущем может показать свою эффективность при терапии MYO7A, ассоциированного с USH1. Также разрабатывается генно-терапевтический препарат UshStat (компания Sanofi совместно с Oxford biomedica) с доставкой правильно работающей копии гена MYO7A на лентивирусном носителе [22–25], однако продвижения в этой области происходят относительно медленно, в т. ч. в связи с повышенной иммуногенностью лентивирусной технологии доставки.

USH2A — ген, кодирующий белок ушерин, расположен на 1-й хромосоме и имеет 72 экзона. Ушерин содержит участки ламинина эндотелиального ростового фактора, домен пентаксина и множество участков фибронектина типа III, он находится в базальной мембране и важен для развития и поддержания гомеостаза внутреннего уха и сетчатки. Для этого гена было найдено несколько вариантов транскриптов, кодирующих разные изоформы белка. Мутации в гене USH2A являются наиболее частой причиной аутосомно-рецессивного несиндромального пигментного ретинита и USH2 в мировой статистике, однако в нашей группе пациентов в связи с особенностями формирования когорты (по критериям включения в группу принимались пациенты с наиболее серьезными нарушениями) большой процент составили пациенты с USH1. Никталопия и потеря периферического поля зрения в течение первых двух десятилетий, прогрессирующая с возрастом, наблюдались у пациентов с этим типом заболевания, хотя темпы прогрессирования варьировались с существенной внутри- и межсемейной фенотипической изменчивостью. Терапевтические подходы к коррекции недостаточной функции белка ушерина в связи с большим размером гена затруднены, однако разрабатываются различные подходы к доставке более длинных генов (так называемые наночастицы) и попытки замены частей гена (генная терапия мутаций в 13-м экзоне гена USH2A, разрабатываемая компанией ProQR), в т. ч. с применением технологии CRISPR [26]. Описание исследованной российской когорты пациентов с синдромом Ашера и частота мутаций в генах, наиболее частых при данном синдроме, представлены на рисунке 3 и в таблице 1.

PCDH15 — ген суперсемейства кадгеринов, кодирует один из подтипов протокадгерина, расположен на 10-й хромосоме и насчитывает 48 экзонов. Протокадгерины кодируют интегральные мембранные белки, которые обеспечивают кальций-зависимую клеточно-клеточную адгезию. Он играет существенную роль в поддержании нормальной функции сетчатки и кортиева органа. CDH23 вместе с PCDH15 образуют концевые звенья, которые соединяют стереоцилии, что крайне важно для поддержания жизнеспособности фоторецепторов и клеток кортиева органа. Мутации в этом гене приводят к потере слуха и развитию USH1. Характерен альтернативный сплайсинг, что приводит к появлению нескольких изоформ белка [27].

USH1C — ген ушерин 1С, расположен на 11-й хромосоме, имеет 29 экзонов. Этот ген кодирует белок-каркас, который участвует в сборке белковых комплексов. Белок содержит PDZ-домены, область сверхскрученной спирали с двойным сигналом ядерной локализации. Дефекты в этом гене являются причиной развития USH1C и несиндромальной нейросенсорной тугоухости аутосомно-рецессивного типа 18. Для этого гена было обнаружено множество вариантов транскриптов, кодирующих разные изоформы белка.

CDH23 — кадгерин-связанный белок 23-го подтипа, расположен на 10-й хромосоме, имеет 71 экзон. Этот ген также является членом суперсемейства кадгеринов. Белок с этого гена участвует в организации стереоцилий и формировании ресничек фоторецепторов. USH1D и несиндромальная аутосомно-рецессивная глухота DFNB12 вызваны аллельными мутациями этого кадгерин-подобного гена. Описаны альтернативные варианты сплайсинга, кодирующие разные изоформы этого белка [28].

Терапевтические подходы к коррекции функции генов USH1C, CDH23 и PCDH15 пока ограничиваются косвенными методиками — использованием аминогликозидов как ex vivo, так и in vivo для считывания преждевременных стоп-кодонов или нонсенс-мутаций [29]. Аминогликозиды в данном случае работают путем ослабления строгого механизма отбора рибосомой при синтезе белка из мРНК. Как при антибактериальном действии, когда они нарушают правильную генерацию полипептидов бактерий, так и в этом случае, расслабляя трансляцию, аминогликозид позволяет вставлять аминокислоту в область стоп-кодона вместо обрыва синтеза белка. Хотя эта аминокислота может быть не той аминокислотой, которая наблюдается в белке дикого типа, существует возможность восстановления правильной функции или по крайней мере лучшая функциональность получаемого белка ушерина, кадгерина или протокадгерина.

Заключение

Авторами изложены результаты наблюдательного клинического исследования NCT03319524 и проведен подробный компьютерный анализ метаболома и интерактома, а также патогенетических путей развития USH в обследуемой когорте пациентов с обсуждением важности патогенетически направленных подходов к терапии и наиболее перспективных подходов к терапевтическому воздействию, в т. ч. с применением генной терапии.

Финансирование/Funding

Исследование спонсировано БФ «Фонд поддержки слепоглухих «Со-единение» и АНО «Лаборатория Сенсор-Тех».

Autonomous non-commercial organization Laboratory “Sensor technology for deafblind” and Deaf-Blind Support Foundation “Con-nection”.