Генная терапия – достаточно молодой, но очень перспективный метод лечения заболеваний человека с помощью введения специальных терапевтических генетических конструкций в пораженные клетки организма.
Одним из главных направлений, в котором генотерапия активно развивается, наряду с наследственными генетическими, инфекционными и сосудистыми заболеваниями, является онкологическая патология.
Доказано, что существуют онкогены, которые стимулируют превращение здоровой клетки в опухолевую, и гены–супрессоры, которые данный процесс инактивируют, нарушения в их работе также приводят к перерождению нормальных клеток в опухолевые. Генотерапия направлена на нормализацию работы как онкогенов, так и генов–супрессоров.
Основными методами генной терапии являются:
• добавление гена;
• ингибирование гена;
• заместительная генная терапия;
• уничтожение специфических генов.
Пути доставки генов в пораженные клетки:
1. ex vivo – пораженные клетки выделяют из организма, генетически модифицируют в культуре и снова вводят в организм пациента.
2. in vivo – в случае недоступности клеток или невозможности их эффективно культивировать используют прямое введение ДНК в клетки, находящиеся в организме.
Условия успешной генотерапии:
• обеспечение эффективной доставки чужеродного гена в клетки–мишени;
• обеспечение длительного функционирования его в этих клетках;
• создание условий для полноценной работы гена (его экспрессии).
Эффективность генотерапии определяется прежде всего механизмом доставки терапевтического генетического материала – так называемой «векторной системой».
Существуют вирусные и невирусные векторные системы. В настоящее время наиболее эффективной считается вирусная доставка генов (трансдукция), которая представляет собой упаковку ДНК в вирусную частицу. Перенос генов осуществляется путем нормальной вирусной инфекции, поэтому он эффективен и селективен по отношению к клеткам.
При невирусной доставке (трансфекция) клетки заставляют поглощать ДНК из окружающей среды. ДНК не упаковывается в вирусный вектор, а часто присутствует в составе плазмиды. В некоторых случаях плазмида сконструирована таким образом, что не способна реплицироваться в человеческих клетках, и тогда единственный путь достижения долгосрочной экспрессии – стабильная интеграция ДНК в геном.
В генотерапии рака используют:
• ретровирусные векторные системы;
• аденовирусные векторы;
• векторы на основе аденоассоциированных вирусов (ААВ);
• векторы на основе вирусов герпеса;
• вирусные векторы направленного действия;
• мультифункциональные частицы на основе вирусных векторов (МФЧ).
Только вирусные векторы или генетические конструкции, включающие вирусные последовательности, способны к активной трансдукции, а в некоторых случаях – и к длительной экспрессии чужеродных генов. Из более чем 175 уже одобренных протоколов клинических испытаний по генотерапии более 120 предполагают использовать вирусную трансдукцию и около 100 из них основаны на применении ретровирусных векторов.
Ретровирусы – это РНК–содержащие вирусы, имеющие обратную транскриптазу, дающую возможность синтезировать ДНК–копию их генома. Копия интегрируется в геном хозяина, приводя к стабильной трансформации и длительной экспрессии перенесенных генов. Типичные ретровирусы инфицируют только делящиеся клетки, поэтому они особенно пригодны для генной терапии рака.
Преимущества:
• эффективность (может быть получен высокий титр вируса, очень высока эффективность инфекции);
• персистенция (стабильная интеграция делает возможной долговременную экспрессию генов).
Недостатки:
• малая емкость (может удерживать чужеродную ДНК размером не более 8 тыс. п.н.).
• небезопасность (интеграция происходит случайным путем, и возникает опасность инсерционного мутагенеза).
Ретровирусный вектор является одной из первых систем генотерапии и сконструирован на основе вируса мышиного лейкоза Molonеy (MoMLV).
Раковые клетки быстро растут и постоянно делятся, как, например, клетки глиомы – одной из наиболее распространенных опухолей мозга. Эксперименты по генотерапии модели глиомы на животных продемонстрировали, что вирусные векторы MoMLV оказались не способными охватывать весь объем опухоли. Для повышения эффективности этой вирусной системы разработали репликационно–компетентный вариант вирусного вектора MoMLV, способный к воспроизводству в инфицированных клетках. Однократное внутричерепное введение репликационно–компетентного варианта вирусного вектора MoMLV приводило к распространению этого вируса далеко за пределы места инъекции, затрагивая только раковые клетки: в здоровых тканях мышей вирусы не обнаружили.
Хотя эксперименты на мышах не выявили значимого токсического эффекта, ретровирусные системы представляют потенциальную опасность для здоровья человека. Они способны активировать онкогены и блокировать опухолевые супрессорные гены в инфицированных клетках.
Онкогенный эффект ретровируса был подтвержден клинически, когда после инфицирования вектором MoMLV стволовых клеток костного мозга детей, страдающих тяжелой комбинированной иммунной недостаточностью, у 4 из 11 детей развилась лейкемия.
Таким образом, для внедрения этих векторов в клиническую практику требуется провести дополнительные исследования, направленные на повышение их безопасности и улучшение инфицирующей способности вирусов.
Аденовирусные векторы. Аденовирусы – это вирусы, которые вызывают легкие формы инфекций верхних дыхательных путей, т.е. обычные простуды. Трансформация происходит эписомальным путем, и вирус может инфицировать широкий диапазон делящихся и неделящихся клеток.
Аденовирусы особенно полезны в тех случаях, когда необходима лишь временная продукция терапевтического гена. Они способны к воспроизводству в больших количествах и характеризуются эффективным переносом генов в различные типы раковых клеток.
Преимущества:
• эффективность (могут быть получены высокие титры);
• емкость (до 35 тыс. п.н. захвата чужеродной ДНК).
Недостатки:
• персистенция (обычно наблюдается кратковременная экспрессия);
• небезопасность (аденовирусные векторы вызывают воспалительные реакции).
Все испытания методов генной терапии с участием аденовируса были приостановлены для изучения вопросов безопасности.
Векторы на основе аденоассоциированных вирусов. ААВ содержат одноцепочечную ДНК и вызывают асимптоматические инфекции. Трансформация происходит путем устойчивой интеграции, и вирус может инфицировать широкий диапазон делящихся и неделящихся клеток.
Векторы на основе ААВ не вызывают токсического эффекта и проявляют высокую инфицирующую способность, как показывают доклинические испытания нескольких таких вирусов. На моделях глиомы у грызунов было продемонстрировано, что ААВ, кодирующий рецептор фактора роста эндотелия сосудов VEGF (vascular endothelial growth factor), способен блокировать рост опухолей. Несмотря на высокую эффективность ААВ, технология их получения и очистки представляет собой достаточно сложный и дорогостоящий процесс.
Преимущества:
• безопасность (вирус требует присутствия аденовируса или вируса герпеса для репликации, т.к. от природы не обладает способностью к ней; может интегрировать в строго определенное место человеческого генома, уменьшая риск инсерционного мутагенеза);
• персистенция (устойчивая интеграция способствует длительной экспрессии).
Недостатки:
• малая емкость (может удерживать ДНК размером менее 5 тыс. п.н.);
• сложность и высокая стоимость.
Векторы на основе вирусов герпеса. Вирус простого герпеса – это ДНК–содержащий вирус, который проявляет повышенный (ярко выраженный) нейротропизм, что делает его особенно привлекательным для генной терапии заболеваний нервной системы. Трансформация эписомальная, и вирус может распространяться через синаптическую сеть.
Благодаря высокой эффективности и несложной методике получения векторы на основе вирусов герпеса пользуются особенной популярностью среди разработчиков векторных систем. В настоящее время со многими вариантами терапевтических векторов на основе вирусов герпеса проводятся клинические испытания. Как в случае векторов на основе других вирусов, терапевтический интерес представляют только репликационно–компетентные штаммы вирусов герпеса. Первый вектор такого рода был создан на основе мутантного вируса герпеса с дефектным геном r34.5, отвечающим за нейротоксичность вируса. Инактивация гена r34.5 ограничила способность вируса к размножению в клетках центральной нервной системы и блокировала возможность его существования в латентной форме. Однако позже обнаружилось, что отсутствие активности гена r34.5 значительно снизило способность мутантного вируса к воспроизводству в раковых клетках.
Терапевтические возможности векторов на основе вирусов герпеса могут существенно ограничиваться наличием иммунитета к нему у пациентов. Иммунный ответ организма предотвращает перенос вирусами терапевтических генов к периферическим органам и вызывает гепатотоксичность. Однако некоторые мутантные штаммы вирусов герпеса продемонстрировали успешное лечение рака печени в модели на мышах, обусловленное, как предполагают ученые, непосредственным вирусным онколизисом и активностью специфических эффекторных клеток иммунной системы.
Преимущества:
• большая емкость (точный верхний предел для встраивания чужеродной ДНК не установлен);
• персистенция (могут установиться пожизненные латентные инфекции в нейронах).
Вирусные векторы направленного действия. Для достижения высокой эффективности доставки генов в раковые клетки был разработан аденовирусный вектор, нацеленный на рецепторный механизм трансцитоза (прохождения сквозь клетки эндотелия) с помощью специальных адаптерных молекул.
Подвергшиеся трансцитозу вирусные частицы сохраняли способность заражать клетки, но эффективность транспорта вирусов сквозь клетки оставалась низкой.
В настоящее время разрабатываются аденовирусные векторы, содержащие как сигнальные молекулы, направляющие вирусы на трансцитоз, так и молекулы, опосредующие связывание и заражение раковых клеток, находящихся «по ту сторону» стенки сосудов.
Мультифункциональные частицы на основе вирусных векторов. Концепция МФЧ направлена на то, чтобы терапевтические вирусные векторы осуществляли сразу несколько функций:
• выполняли адресную доставку генетического материала именно в раковые клетки;
• давали возможность их визуализации в организме;
• обладали бы прогрессирующим онколитическим действием.
Концепция МФЧ на основе вирусных векторов открывает широкие возможности применения нанотехнологий. Мониторинг вирусных частиц можно осуществлять с помощью наноразмерных меток, иммобилизованных на оболочках вирусов. Однако вопрос об адресной доставке вирусных МФЧ в клетки опухоли остается открытым.
Механизмы генотерапии с помощью вирусных векторов:
• коррекционное добавление гена;
• суицидная генотерапия;
• иммуногенотерапия;
• генотерапия, направленная на подавление ангиогенеза;
• технология «молчащих» генов (сайленсинг–генов).
Коррекционное добавление гена. Коррекционное добавление гена основано на замене мутантного гена p53 в раковых клетках геном дикого типа (не содержащим мутаций) с помощью методов генотерапии. Это приводит к полному восстановлению функций белка p53 и запускает апоптоз злокачественных клеток.
Клинические испытания ретровирусных и аденовирусных векторов, несущих неповрежденные гены p53, оказались эффективными в замене дефектных генов p53 у пациентов, страдающих немелкоклеточным раком легкого (НМРЛ) и бронхоальвеолярной карциномой. К сожалению, в клинических испытаниях не удалось обнаружить значительного терапевтического эффекта даже при совместном применении аденовирусных векторов, рекомбинантных по гену p53 дикого типа, и химиотерапии.
Суицидная генотерапия. Суть суицидной генотерапии заключается в доставке в злокачественные клетки гена, кодирующего фермент, который конвертирует пролекарство в лекарство – «суицидный токсин», вызывающий гибель зараженных раковых клеток.
Основной проблемой, препятствующей применению этой стратегии в клинической практике, является низкая эффективность доставки терапевтических генов.
Иммуногенотерапия. Еще один механизм генотерапии злокачественных новообразований основан на индукции иммунного ответа организма, направленного на разрушение опухолей. В отличие от коррекционной замены гена и суицидной генотерапии иммунная генотерапия обладает теоретическим преимуществом, поскольку кроме временного воздействия на опухоль иммунной системы возможен пролонгированный противоопухолевый эффект, связанный с иммунологической памятью. Такая методика особенно полезна для элиминации метастазов, обнаруживаемых в разных органах и системах организма.
Генотерапия, направленная на подавление ангиогенеза. Злокачественные опухоли характеризуются усиленным ангиогенезом. Данный подход генотерапии нацелен на подавление формирования кровеносных сосудов в раковых опухолях. Известно несколько ингибиторов ангиогенеза (например, ангиостатин и эндостатин), вызывающих регрессию опухолей посредством подавления образования кровеносных сосудов.
Опухолевый ангиогенез можно подавить также с помощью доставки в сосуды опухоли генов, продукты которых блокируют образование кровеносных сосудов.
Технология «молчащих» генов (сайленсинг–генов). Одна из новейших технологий в генотерапии рака направлена на сайленсинг (от англ. «silence» – молчание) генов, отвечающих за рост и деление раковых клеток. «Заглушить» гены можно, например, с помощью механизма РНК–интерференции, при котором связывание коротких двунитевых молекул РНК с регуляторной последовательностью гена–мишени вызывает остановку синтеза продукта этого гена. С помощью РНК–интерференции ученым удалось добиться сайленсинга гена, кодирующего рецептор эпидермального фактора роста, что вызвало подавление роста клеток НМРЛ.
Эффективная генотерапия рака станет возможной при получении такого вектора, который мог бы онколитически воздействовать как на саму опухоль, так и на ее метастазы, находящиеся в разных тканях организма. Этим требованиям отвечают споры клостридий.
Клостридии – строго анаэробные грамположительные бактерии, имеющие палочковидную форму, способные образовывать споры при неблагоприятных условиях. Для роста всех видов клостридий необходимы анаэробные условия, но устойчивость этих бактерий к концентрации кислорода в среде варьирует от вида к виду.
Внутривенное введение спор клостридий продемонстрировало значительное преимущество этого метода в лечении рака перед известными методами, поскольку их споры достаточно легко получить и хранить. Прорастание спор происходит только в том случае, если они попадают в анаэробные условия.
Для лечения заболеваний человека нельзя использовать патогенные виды бактерий. Одним из первых непатогенных штаммов клостридий стал C. butyricum M–55, который впоследствии назвали C. oncolyticum, а затем – C. sporogene (ATCC13732). Этот штамм клостридий обладает онколитическим действием. Противораковый эффект генетически модифицированных штаммов клостридий представлен в таблице 1.
Сахаролитические клостридии, включая штаммы C. beijerinckii ATCC17778, C. acetobutylicum DSM792 (ATCC824) или C. acetobutylicum NI4082 (реклассифицированный как C. saccharoperbutylacetonicum) и C. butyricum, непатогенны. Разработка этих штаммов для нужд генотерапии была профинансирована биотехнологическими компаниями. В эти штаммы вводили терапевтические гены, кодирующие TNF–α, CD и NTR, оценивали уровень продукции клостридиями рекомбинантных белков и анализировали противораковый эффект модифицированных спор. Однако тестирование C. acetobutylicum, модифицированного CD, на моделях солидных опухолей у животных не выявило значительного онколитического действия. Предположительно, низкая эффективность рекомбинантного штамма связана с недостаточной колонизацией опухолей клостридиями. Векторы на основе «суперколонизаторов» опухолей – штаммов клостридий C. sporogenes и C. novyi–NT, рекомбинантных по NTR, продемонстрировали значительный противоопухолевый эффект при их совместном использовании с пролекарством CB1954. Преимущества генотерапии на основе спор клостридий перед вирусной генотерапией представлены в таблице 2.
Другим перспективным направлением в лечении злокачественных новообразований является генотерапия, основанная на применении наночастиц. На ежегодной сессии Американской ассоциации анатомов 18 апреля 2009 г. группа ученых под руководством доктора Э. Чанга представила наночастицы, являющиеся сферами из молекул липидов, внутри которых находится полнофункциональная копия гена опухолевого супрессора р53.
Снаружи наночастицы покрыты антителами, специфическими к белкам, типичным для раковых клеток. Это позволяет обеспечить целевую доставку гена–онкосупрессора по кровотоку к клеткам самой опухоли и ее метастазов. В результате работы нормального гена р53 останавливается рост опухоли.
Благодаря тому, что молекулы липидов, попав внутрь клетки, просто растворяются, как любая капелька жира, такая система целевой доставки не имеет собственных побочных эффектов, чем выгодно отличается от ранее использованных для тех же целей наночастиц из материалов, не поддающихся биодеградации.
В настоящее время клинические испытания проходят первую стадию. В эксперименте принимают участие 6 пациентов с различными видами рака, всего дали согласие на участие 14 человек. По утверждению д–ра Э. Чанга, уже получены многообещающие результаты. В случае успеха генная терапия онкологических заболеваний может сделать заметный шаг вперед благодаря не только большей эффективности лечения, но и достоверному снижению вероятности развития вторичных опухолей.
Реальности генотерапии. Несмотря на значительный прогресс этого направления, быстрого успеха генная терапия не достигла: до сих пор ни одна болезнь не побеждена и до настоящего времени в клинике нет ни одного завершенного метода лечения.
Терапия находится на самом начальном этапе, т.к. не решена проблема корректировки самого генома, а ее развитие пошло по пути реализации экстрахромосомной экспрессии введенных генетических конструкций.
Генотерапия злокачественных новообразований с помощью генов цитокинов, генов самоубийства клеток, генов, контролирующих апоптоз, и ряда других генетических конструкций не гарантирует полного излечения, т.к. если в результате лечения остаются единичные трансформированные клетки, то опухоль может дать рецидив.
Литература
1. Киселев С.Л. Современная генная терапия: что это такое и каковы ее перспективы?// Практическая онкология. 2003. Т. 4, № 3. С. 170.
2. Примроуз С., Тваймен Р. Геномика. Роль в медицине. М.: БИНОМ. Лаборатория знаний, 2008.
3. Ram Z., Culver K.W., Oshiro E.M., Viola J.J., DeVroom H.L., Otto E., Long Z., Chiang Y., McGarrity G.J., Muul L.M., Katz D., Blaese R.M., Oldfield E.H.
4. Tai C.K., Wang W.J., Chen T.C., Kasahara N. Single–shot, multicycle suicide gene therapy by replication–competent retrovirus vectors achieves long–term survival benefit in experimental glioma // Mol. Ther. 2005. Vol. 12(5). P.842–851.
5. Rein D.T., Breidenbach M., Curiel D.T. Current developments in adenovirus–based cancer gene therapy // Future Oncol. 2006. Vol. 2(1). P.137–143.
6. Flotte T.R. Gene Therapy Progress and Prospects: Recombinant adeno–associated virus (rAAV) vectors // Gene Ther. 2004. Vol. 11(10). P. 805–810.
7. Urabe M., Nakakura T., Xin K.Q. et al. Scalable generation of high–titer recombinant adeno–associated virus type 5 in insect cells // J. Virol. 2006. Vol. 80(4). P.1874–1885.
8. Harland J., Dunn P., Cameron E. et al. The herpes simplex virus (HSV) protein ICP34.5 is a virion component that forms a DNA–binding complex with proliferating cell nuclear antigen and HSV replication proteins // J. Neurovirol. 2003. Vol. 9(4). P.477–488.
9. Derubertis B.G., Stiles B.M., Bhargava A. et al. Cytokine–secreting herpes viral mutants effectively treat tumor in a murine metastatic colorectal liver model by oncolytic and T–cell–dependent mechanisms // Cancer. Gene. Ther. 2007, in press.
10. McIntosh D.P., Tan X.Y., Oh P., Schnitzer J.E. Targeting endothelium and its dynamic caveolae for tissue–specific transcytosis in vivo: a pathway to overcome cell barriers to drug and gene delivery // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 2002. Vol. 99. P.1996–2001.
11. Li J., Le L.P., Sibley D.A. Genetic incorporation of HSV–1 thymidine kinase into the adenovirus protein ix for functioal display on the virion // Virol. 2005. Vol. 338. P.247–258.
12. Pankhurst Q.A., Connolly J., Jones S.K., Dobson J. Applications of magnetic nanoparticles in biomedicine // J. Phys. D. Appl. Phys. 2003. Vol. 36.R167–R181.
13. Roth J.A., Nguyen D., Lawrence D.D., Kemp BL et al. Retrovirus–mediated wild–type p53 gene transfer to tumors of patients with lung cancer // Nat. Med. 1996. Vol. 2. P.985–991.
14. Schuler M., Rochlitz C., Horowitz J.A. et al. A phase I study of adenovirus–mediated wild–type p53 gene transfer in patients with advanced nonsmall cell lung cancer // Hum. Gene Ther. 1998. Vol. 9(14). P.2075–2082.
15. Gahery–Segard H., Molinier–Frenkel V., Le Boulaire C. et al. Phase 1 trial of recombinant adenovirus gene transfer in lung cancer. Longitudinal study of the immune responses to transgene and viral products // J. Clin. Invest. 1997. Vol. 100. P.2218–2226.
16. Nemunaitis J., Swisher S.G., Timmons T. et al. Adenovirus–mediated p53 gene transfer in sequence with cisplatin to tumors of patients with non–smallcell lung cancer // J. Clin. Oncol. 2000. Vol.18. P.609–622.
17. Hwang H.C., Smythe W.R., Elshami A.A. et al. Gene therapy using adenovirus carrying the herpes simplex thymidine kinase gene to treat in vitro models of human malignant mesothelioma and lung cancer // Am. J. Respir. Cell. Mol. Biol. 1995. Vol. 13. P.7–16.
18. Metharom P., Ellem K., Schmidt C., Wei M.Q. Lentiviral vectormediated tyrosinase–related protein–2 gene transfer to dentritic cells for the therapy of melanoma // Hum. Gene Ther. 2001. Vol. 12(18). P.2203–2213.
19. Zhang M., Zhang X., Bai C.X. et al. Inhibition of epidermal growth factor receptor (EGFR) by RNA interference in A549 cells // Acta Pharmacol. Sin. 2004. Vol. 25(1). P.61–67.
20. Theys J., Landuyt A.W., Nuyts S. et al. Clostridium as a tumor–specific delivery system of therapeutic proteins // Cancer. Detect. Prev. 2001. Vol. 25(6). P.548–557.
21. Van Mellaert L., Barbe S., Anne J. Clostridium spores as antitumour agents // Trends Microbiol. 2006. Vol. 14(4). P.190–196.
22. Theys J., Pennington O., Dubois L. et al. Repeated cycles of Clostridium–directed enzyme prodrug therapy result in sustained antitumour effects in vivo // Br. J. Cancer. 2006. Vol.95(9). P.1212–1219.
23. Folkman J. What is the evidence that tumors are angiogenesis dependent? // J. Natl. Cancer. Inst.1990. Vol. 82. P.4–6.
24. Vaupel P., Mayer A. Hypoxia in cancer: significance and impact on clinical outcome // Cancer. Metastasis Rev. in press. 2007, Apr 18.
25. Hay J.G. The potential impact of hypoxia on the success of oncolytic virotherapy // Curr. Opin. Mol. Ther. 2005. Vol. 7(4). P. 353–358.
26. Xu L., Frederik P., Pirollo K.F. et al. Self–assembly of a virus–mimicking nanostructure system for efficient tumor–targeted gene delivery. // Hum. Gene Ther. 2002. Vol. 10;13(3). P.469–481.
